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　　基于十多年的技术积累和革新ღ★✿★，体外转录（IVT） RNA技术的关注度因新冠mRNA疫苗的成功提升到了空前的高度ღ★✿★。RNA在理论上可以生产出任何一种人类所需的蛋白质ღ★✿★，用于传染病预防ღ★✿★、肿瘤治疗校霸被校草强迫Hღ★✿★、蛋白替代治疗ღ★✿★、细胞治疗ღ★✿★、再生医学等领域ღ★✿★，mRNA的科研价值和商业价值无可比拟ღ★✿★。与mRNA相比ღ★✿★，环状RNA(circRNA)具有更高的稳定性ღ★✿★，并且未修饰转录本的免疫原性也较低ღ★✿★。circRNA的这两个关键优势ღ★✿★，可以充分发挥RNA疗法的全部潜力ღ★✿★。

　　2023年ღ★✿★，中国食品药品检定研究院（简称中检院）研究团队在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上发表综述《Research progress on circular RNA vaccines》ღ★✿★，总结了circRNA的发现ღ★✿★、体内代谢和生物学功能ღ★✿★，以及circRNA疫苗的研究进展ღ★✿★、生产过程ღ★✿★、质量控制中的主要挑战及解决策略等ღ★✿★，以期为circRNA疫苗相关研究提供参考ღ★✿★。

　　COVID-19 mRNA疫苗是首个获批的mRNA疫苗ღ★✿★，其可诱导高水平的体液免疫和细胞免疫反应校霸被校草强迫Hღ★✿★，全球已接种超40亿剂mRNA疫苗ღ★✿★，约占免疫接种总数的1/3ღ★✿★。目前ღ★✿★，约40种mRNA疫苗处于临床试验阶段ღ★✿★，其中多种已批准上市或获得紧急使用授权ღ★✿★。

　　COVID-19 mRNA疫苗为线性结构ღ★✿★，稳定性差ღ★✿★。circRNA因具有由共价键形成的单链闭环结构ღ★✿★，在体内具有较高稳定性ღ★✿★，且可进行蛋白质编码和翻译ღ★✿★，为疫苗开发提供潜力ღ★✿★。开发的COVID-19 circRNA疫苗ღ★✿★，不仅具有线性mRNA疫苗的优势（快速和可编辑性等）ღ★✿★，且在一定温度范围内比线性mRNA疫苗具更高的稳定性和更长的蛋白表达时间ღ★✿★，低剂量即可引发强烈的免疫反应ღ★✿★。因此校霸被校草强迫Hღ★✿★，一些研究人员认为circRNA疫苗可成为应对未来新型重大传染病或其他常见病毒性疾病（如HBVღ★✿★、HHVღ★✿★、EBVღ★✿★、IAV和HPV）的有力工具ღ★✿★，并可能开发用于细胞疗法或治疗性肿瘤疫苗ღ★✿★。

　　1971年ღ★✿★，在马铃薯纺锤体块茎病研究中发现可入侵植物并致植物死亡的缺少蛋白外壳的病毒样分子ღ★✿★，称为“类病毒”ღ★✿★。1976年Sanger等人首次将类病毒描述为单链共价闭合的circRNA分子ღ★✿★。1979年ღ★✿★，Hsu和Coca-Prados使用电子显微镜发现HeLa细胞中存在无自由侧翼末端的circRNA分子ღ★✿★，首次报道在真核细胞中观察到circRNA分子ღ★✿★。1990年代初澳门太阳集团网站入口ღ★✿★，鉴定并表征由内源性RNA产生的circRNAღ★✿★。

　　后续研究提出了产生这类分子的机制ღ★✿★，如假设反向重复序列是Sry环化所必需的ღ★✿★。2010年起ღ★✿★，随着RNA测序和生物信息学技术的发展ღ★✿★，揭示了不同生物体（如人类澳门太阳集团网站入口ღ★✿★、小鼠校霸被校草强迫Hღ★✿★、植物校霸被校草强迫Hღ★✿★、隐球菌ღ★✿★、斑马鱼和原生生物）中存在多种高度保守的circRNAღ★✿★，使circRNA研究爆炸式增长ღ★✿★。2015年ღ★✿★，首次报道能编码和翻译蛋白的circRNAღ★✿★。2017年开始ღ★✿★，现代分子生物学实验技术的应用使先前研究发现的各种circRNA得以验证ღ★✿★。2018年研究人员成功合成能表达蛋白质的circRNAღ★✿★，用于疫苗开发ღ★✿★。2022年ღ★✿★，开始研究COVID-19 circRNA疫苗和治疗性肿瘤或遗传疾病疫苗ღ★✿★。

　　RNA经反向剪接和外显子跳跃在体内循环ღ★✿★。反向剪接的RNA环化是RNA出现断点后ღ★✿★，下游5剪接供体位点与上游3剪接受体位点的反向连接ღ★✿★，后内含子序列经选择性剪切产生circRNA太阳成集团官网ღ★✿★。ღ★✿★。外显子跳跃实现的RNA环化是外显子与内含子剪接后发生环化的过程ღ★✿★。不同的断点位置有助于circRNA的多样性ღ★✿★，不同类型的circRNA由外显子ღ★✿★、内含子ღ★✿★、基因间区域或非转录区域通过反向剪接随机组合产生ღ★✿★。

　　根据序列组合差异ღ★✿★，circRNA分为4类ღ★✿★：（1）外显子circRNAღ★✿★：仅含外显子ღ★✿★，占总circRNA的80%以上ღ★✿★，通过套索驱动的环化或直接反向剪接环化产生ღ★✿★。两个侧翼内含子间的碱基配对使下游5ss和上游3ss结合ღ★✿★，促进反向剪接反应以产生circRNAღ★✿★；（2）外显子-内含子circRNAღ★✿★：又称eiciRNAღ★✿★，由外显子跳跃环化产生ღ★✿★，隐藏在核心外显子的侧翼内含子序列通常需剪接ღ★✿★；（3）内含子circRNAღ★✿★：由从套索衍生机制的分枝中逃脱的内含子产生ღ★✿★，依赖于前体mRNA 5剪接位点附近共有鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）富集结构域和断点附近富含胞嘧啶（C）结构域ღ★✿★。富含GU的结构域可保护富含C结构域不发生分支或降解ღ★✿★，产生稳定circRNAღ★✿★；（4）tRNA内含子circRNAღ★✿★：由前体tRNA被tRNA剪接核酸内切酶（TSEN）复合物切割裂解产生的外显子和内含子连接形成ღ★✿★。

　　（1）基因转录调节ღ★✿★：circRNA可与宿主DNA结合形成R-loopღ★✿★，影响DNA复制澳门太阳成集团ღ★✿★，ღ★✿★、转录和损伤后修复ღ★✿★。如circSEP3通过与cSMARCA5形成R-loop导致转录终止ღ★✿★；circRHOT1将Tat互作蛋白60kDa（TIP60）募集到NR2F6启动子上ღ★✿★，诱导原癌基因表达促进肝细胞癌中的细胞增殖ღ★✿★、迁移和侵袭ღ★✿★。

　　（2）“海绵”效应ღ★✿★：天然circRNA对microRNA（miRNA）或蛋白表现出“海绵”效应ღ★✿★。如circHIPK3与miR-124结合并抑制其活性ღ★✿★；circHIPK2通过靶向miR124-2HG调节星形胶质细胞活化ღ★✿★；circNfix与Ybx1（过表达导致不良预后及各种肿瘤复发）和Nedd4l结合ღ★✿★，促进其相互作用并诱导Ybx1降解ღ★✿★。

　　（3）通过形成复合物激活蛋白ღ★✿★：EBV感染宿主后产生circBART2.2ღ★✿★，被细胞RIG-I受体识别ღ★✿★，RIG-I受体被激活后通过下游干扰素信号通路实现抗病毒作用ღ★✿★。但m6A甲基化修饰后的circRNA未被RIG-I受体识别ღ★✿★。

　　（4）蛋白翻译ღ★✿★：2015年在果蝇中首次发现circRNA编码和翻译蛋白的能力ღ★✿★。circRNA由IRES或MIRES介导翻译起始ღ★✿★：IRES将核糖体募集到mRNA内部区域以启动翻译ღ★✿★，可通过募集不同反式作用因子促进核糖体组装和启动翻译ღ★✿★，如circMbl和circFGFR1ღ★✿★；MIRES介导的翻译起始涉及RNA中一或多个位点发生m6A甲基化ღ★✿★，使eIF4G2的募集用于翻译起始ღ★✿★。

　　人工制备circRNA的方法ღ★✿★：（1）化学合成ღ★✿★：BrCN或EDC诱导线端羟基间形成共价键ღ★✿★，产生circRNA澳门太阳集团网站入口ღ★✿★，但该过程易产生2-5磷酸二酯键ღ★✿★；（2）T4 RNA连接酶连接ღ★✿★：线 RNA连接酶作用形成共价键而环化校霸被校草强迫Hღ★✿★，因此使用T7 RNA聚合酶体外合成的RNA在环化前须去除两个磷酸基团ღ★✿★，其中RppH用于去除β和γ磷酸ღ★✿★；（3）内含子自剪接ღ★✿★：I/II类内含子可执行RNase功能ღ★✿★，使线性RNA分子形成circRNA校霸被校草强迫Hღ★✿★。

　　2015年太阳成ღ★✿★，ღ★✿★，通过构建含分裂GFP的单外显子小基因ღ★✿★，发现前体mRNA可在人和果蝇细胞中高效反向剪接产生可翻译circRNAღ★✿★。2018年ღ★✿★，使用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法合成编码EGFP的circRNAღ★✿★，在293T细胞持续表达168hღ★✿★，而线hღ★✿★。目前人工合成表达蛋白的circRNA主要通过内含子剪接（图4A）或T4 RNA连接酶连接（图4B）产生ღ★✿★。

　　Wei等人采用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法开发一种针对原始COVID-19毒株的LNP-circRNA疫苗ღ★✿★。分别以10μgღ★✿★、50μg/只剂量免疫小鼠ღ★✿★，均引起较强的Th1免疫反应ღ★✿★。猴子接受两剂100μg/只的疫苗后进行原始病毒株攻击实验ღ★✿★，免疫组肺部病毒载量ღ★✿★、肺损伤程度和肺部浸润性炎症细胞数量显著降低ღ★✿★。随后针对COVID-19 Delta变体ღ★✿★、Omicron BA1变体的circRNA疫苗实验证明疫苗的广谱活性及高稳定性ღ★✿★。

　　Wang等人使用II类内含子剪接法制备COVID-19 circRNA疫苗用于小鼠免疫ღ★✿★，引发强烈的RBD特异性记忆B细胞反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应ღ★✿★，血清IgG滴度为线 dt内含子剪接法进行RNA环化会产生“剪接疤痕”序列ღ★✿★，不同的序列长度导致不同的拓扑结构ღ★✿★。circRNA组成元件及组成差异（载体拓扑结构ღ★✿★、非翻译区（UTR）和IRES等）影响翻译效率澳门太阳集团网站入口ღ★✿★。通过不同剪接疤痕ღ★✿★、5UTRღ★✿★、3UTR和IRES序列的实验对比ღ★✿★，发现使用50nt长剪接疤痕序列和Apt-eIF4G序列作为5UTRღ★✿★、全长HBA1序列作为3UTR及野生型iCVB3序列作为IRES构建的circRNA翻译效率显著提高ღ★✿★，在293T细胞中持续表达7天ღ★✿★，而线天ღ★✿★。

　　（1）体内降解方法不同ღ★✿★；（2）circRNA疫苗主要使用IRES介导的翻译途径ღ★✿★，线GpppN）结构介导的翻译途径ღ★✿★，二者通过涉及不同起始因子的转录起始复合体翻译成蛋白ღ★✿★；（3）circRNA疫苗因环形结构不易被降解而无需修饰ღ★✿★，线性mRNA疫苗需假尿苷澳门太阳集团网站入口ღ★✿★、5帽和3poly（A）等修饰ღ★✿★。

　　其中内含子剪接法因无需添加酶而具较好应用前景ღ★✿★，T4 RNA连接酶连接也可用于circRNA工业化生产ღ★✿★，但对序列长度2000nt的RNA分子环化效率较低ღ★✿★；

　　环化反应会产生如线性RNA前体ღ★✿★、剪接的RNA序列等杂质ღ★✿★，常采用色谱法去除ღ★✿★。由于提高RNA环化效率导致杂质含量降低ღ★✿★，因此提高环化效率可能是简化纯化过程的可行方法ღ★✿★。有研究表明ღ★✿★，在pH=7.5且终浓度为50mM Tris-HClღ★✿★、10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲溶液中进行环化ღ★✿★，有效提高RNA环化效率ღ★✿★。

　　WHO发布关于评估mRNA疫苗预防传染病的质量ღ★✿★、安全性和有效性的监管考虑指导文件ღ★✿★。USP制定了mRNA疫苗质量分析程序ღ★✿★，NMPA药物评价中心（CDE）发布了预防性COVID-19 mRNA疫苗药物研究技术的指导原则（试行）ღ★✿★，上述指导文件可作为制定circRNA疫苗质量控制过程的参考ღ★✿★。

　　环化率ღ★✿★、纯度是circRNA疫苗的关键质量属性(CQA)太阳成集团tyc234cc网址ღ★✿★，常利用毛细管电泳（CE）和HPLC测定ღ★✿★。T4 RNA连接酶ღ★✿★、RNase R及dsRNA的残留量使用ELISA进行质量控制ღ★✿★，其中测定疫苗中dsRNA残留量常使用抗dsRNA J2抗体澳门太阳集团网站入口ღ★✿★，但circRNA是否可直接结合抗dsRNA J2抗体或干扰抗dsRNA J2抗体与dsRNA结合的研究尚未报道ღ★✿★，故使用该法前需进行样品适用性分析ღ★✿★。

　　由于研发ღ★✿★、生产ღ★✿★、质量控制和安全等方面的问题澳门太阳集团网站入口ღ★✿★，circRNA的研究仍处于临床前阶段ღ★✿★，后续通过优化条件或开发新型方法解决上述问题对于使circRNA疫苗成为应对未来新型重大传染病ღ★✿★、常见病毒性疾病工具或治疗性肿瘤疫苗至关重要ღ★✿★。